黄曲霉毒素B1检测试剂盒使用说明书

（酶联免疫法）

1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测谷物、饲料等样本中的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样本溶液，样本中的黄曲霉毒素B1和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含黄曲霉毒素B1含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留量。

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2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～15min

2.3 检测下限：

谷物…………………………………………0.15ppb

玉米皮、麸皮等吸水性强样本……………0.6ppb

食用油、花生油……………………………0.6ppb

酱类、饼干、糕点等食品或调料…………0.6ppb

啤酒…………………………………………0.3ppb

葡萄酒、酱油、醋…………………………0.15ppb

茶叶…………………………………………0.2ppb

麦类…………………………………………1.2ppb

2.4 交叉反应率：

黄曲霉毒素B1…………………………100%

2.5 样本回收率：

谷物…………………………………85±15%

花生油………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

酱类、饼干、糕点等食品或调料…83±15%

啤酒…………………………………84±15%

葡萄酒、酱油、醋…………………87±15%

茶叶、麦类…………………………75±15%

3 试剂盒组成

酶标板……………………………96孔

标准液（黑盖）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb

高标准液：100ppb …………………1ml

酶标记物（红盖） …………………5.5ml

抗体工作液（蓝盖） ………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

说明书 ………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：甲醇、正己烷、三氯甲烷

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：样本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去离子水=7：3。

配液2：工作洗涤液

将20×浓缩洗涤液20倍稀释(1份20×浓缩洗涤液加19份去离子水)。

配液3：样本复溶液

35%甲醇，即V甲醇:V去离子水=3.5：6.5。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 谷物处理方法

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加5ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：5 检测下限：0.15ppb

5.3.2 玉米皮、麦麸等吸水性强样本处理方法

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加20ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀；（对于毒素含量极高的样本可用样本复溶液（配液3）稀释后再测。比如取2）中的混合液0.1ml加0.9ml样本复溶液（配液3）混匀，最终样本稀释倍数为200，检测下限为6ppb。）

3）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：20 检测下限：0.6ppb

注：由于毒素在样本中的分布呈非均匀状态，取样时需多点取样充分混匀后再取2g进行试验。

5.3.3 食用油、花生油处理方法

1）称取2ml样本于50ml离心管中，加8ml正己烷和10ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）去除上层液体，取0.5ml下层液体加入0.5ml去离子水，混匀，再取混匀液体0.5ml加入0.5ml样本复溶液（配液3），振荡30s；

3）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：20 检测下限：0.6ppb

5.3.4 酱类、饼干、糕点等食品或调料处理方法

1）称取1g±0.05g粉碎样本至15ml离心管中，加10ml甲醇，振荡5分钟，室温4000转/分离心5分钟；

2）取2ml上清至15ml离心管中，于50℃-60℃下氮气或空气吹干；

3）加入2ml去离子水，振荡30s，再加入6ml三氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分离心5分钟；

4）取下层三氯甲烷液1.5ml至10ml离心管，于50℃-60℃下氮气或空气吹干；

5）加入0.5ml正己烷，振荡30s，再加入1ml样本复溶液（配液3），振荡1分钟，室温4000转/分离心5分钟；

6）去除上层有机物相，取下层清液50µl分析。。

样本稀释倍数：20倍 检测下限：0.6ppb

5.3.5 啤酒处理方法

1）将啤酒充分搅拌（去除二氧化碳），取2ml啤酒样本，加入1ml蒸馏水，再加入7ml甲醇，振荡5分钟；

2）取混匀后的样本液0.5ml加入0.5ml去离子水，混匀；

3）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：10 检测下限：0.3ppb

5.3.6 葡萄酒、酱油、醋处理方法

1）取2ml样本，加入2ml蒸馏水，再加入10ml三氯甲烷，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取下层液体1ml于50-60℃下氮气或空气下吹干；

3）加入0.5ml样本提取液（配液1）充分溶解干燥物，再加入0.5ml去离子水，混匀；

4）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：5 检测下限：0.15ppb

5.3.7 茶叶处理方法

1）称取2g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加4ml甲醇溶液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.3ml上清，加入0.6ml去离子水，混匀；

3）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：6 检测下限：0.2ppb

5.3.8 麦类处理方法

1）称取1g±0.05g粉碎样本于50ml离心管中，加入2ml样本提取液（配液1），振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取0.2ml上清，加入0.2ml去离子水，振荡30秒，室温4000转/分离心5分钟；

3）取离心后的样本液0.1ml加入0.9ml样本复溶液（配液3），混匀。

4）取50µl进行分析。

样本稀释倍数：40 检测下限：1.2ppb

【企业名称】广州华南生物工程有限公司